含2-二甲基環丙烷甲醯胺亞基的植物二萜類化合物，主要存在於大戟科物種中，特殊的生物活性和結構決定了其在製藥和工業應用中的重要作用。然而，由於植物中的天然含量極低，而化學合成又很困難，這就限制了該類化合物的工業應用。本研究希望在菸草中建立二萜類化合物的生物合成途徑。

研究人員首先透過上調擬南芥非甲戊酸（nonmevalonate， MEP）途徑的關鍵基因來提高二萜化合物前體GGPP（香葉基焦磷酸酯，geranylgeranylpyrophosphate）的產量。研究者使用瞬時表達的方式評估了8個MEP途徑上的基因以及GGPP合成酶基因和麻風樹酪蛋白合成酶基因（JcCAS）的組合效果，以確定從GGPP中生產蓖麻烯（casbene）的最佳組合。與單獨瞬時表達

JcCAS

相比，

AtDXS

和

AtHDR

與

AtGGPPS

和

JcCAS

共表達可將蓖麻烯產量提高410%。研究者將這些基因構建到一個單一的載體上，並將其穩定整合到菸草基因組中。此外，還將兩個魔芋細胞色素P450基因——JcCYP726A20和JcCYP71D495和JcCAS在菸草中穩定表達，以從蓖麻烯中產生更復雜的二萜類化合物（jolkinol C），而這需要同時表達前體相關基因，例如一個烯醛還原酶類家族基因。

該研究揭示了最佳化表達生物合成前體物質在合成複雜的二萜類化合物中的必要性，為合成生物學和代謝途徑構建提供了重要的經驗借鑑。

英文摘要：

Plant Biotechnology Journal， 03 March 2021

Developing a

Nicotiana benthamiana

transgenic platform for high-value diterpene production and candidate gene evaluation

Author

Edith C。 F。 Forestier， Tomasz Czechowski， Amy C。 Cording， Alison D。 Gilday， Andrew J。 King， Geoffrey D。 Brown， Ian A。 Graham

Centre for Novel Agricultural Products， Department of Biology， University of York， UK

Abstract

To engineer

Nicotiana benthamiana

to produce novel diterpenoids， we first aimed to increase production of the diterpenoid precursor geranylgeranyl pyrophosphate （GGPP） by upregulation of key genes of the nonmevalonate （MEP） pathway sourced from

Arabidopsis thaliana

。 We used transient expression to evaluate combinations of the eight MEP pathway genes plus GGPP synthase and a

Jatropha curcas

casbene synthase （

JcCAS

） to identify an optimal combination for production of casbene from GGPP。

AtDXS

and

AtHDR

together with

AtGGPPS

and

JcCAS

gave a 410% increase in casbene production compared to transient expression of

JcCAS

alone。 This combination was cloned into a single construct using the MoClo toolkit， and stably integrated into the

N. benthamiana

genome。 We also created multigene constructs for stable transformation of two

J. curcas

cytochrome P450 genes，

JcCYP726A20

and

JcCYP71D495

that produce the more complex diterpenoid jolkinol C from casbene when expressed transiently with

JcCAS

in

N. benthamiana.

Stable transformation of

JcCYP726A20

，

JcCYP71D495

and

JcCAS

did not produce any detectable jolkinol C until these genes were cotransformed with the optimal set of precursorpathway genes。 One such stable homozygous line was used to evaluate by transient expression the involvement of an “alkenal reductase”like family of four genes in the further conversion of jolkinol C， leading to the demonstration that one of these performs reduction of the 12，13double bond in jolkinol C。 This work highlights the need to optimise precursor supply for production of complex diterpenoids instable transformants and the value of such lines for novel gene discovery。