| 編者按 |

作為強大的結構解析工具，冷凍電鏡在解析蛋白質結構中具有超強能力。RNA作為另外一種生物大分子，在生命活動中發揮著與蛋白質同等關鍵的作用，解析它們的三維結構也是科學家們持久探索的問題。但RNA由於分子量小，柔性大等因素，無論是依靠冷凍電鏡還是其他結構解析手段，這一目的在往日很難實現。近日，哈佛大學廖茂富博士和尹鵬博士合作，利用ROCK技術改造RNA，賦能冷凍電鏡技術，解析了多種RNA的高分辨結構，進一步擴充套件了冷凍電鏡技術的應用場景，也為揭示RNA參與的生命活動，以及圍繞RNA的藥物開發，打開了全新局面。

作為遺傳分子DNA的姊妹，RNA支援著我們生活的世界。進化生物學家曾提出假設，認為在DNA和它所編碼的蛋白質出現之前，RNA就已經存在並具有自我複製功能。而現代科學發現，只有不到3%的人類基因組被轉錄成信使RNA（mRNA）分子，並在後續被翻譯成蛋白質。相比之下，82%的基因組被轉錄成具有其他未知功能的RNA分子。

為了瞭解單個RNA分子的功能，在原子和分子鍵的層面上對其三維結構進行解析是極其必要的。透過對DNA和蛋白質分子進行結晶處理，研究人員已經可以透過X射線晶體學方法或核磁共振方法進行常規的結構研究。然而，由於RNA的分子構成和結構柔性特點，它們往往難以結晶，因此這些需要結晶的方法並不適用於解析RNA分子的結構。

近日，哈佛大學韋斯生物啟發工程研究所（Wyss）的尹鵬博士和哈佛大學醫學院（HMS）的廖茂富博士合作完成了一項研究，報告了一種對RNA分子進行結構研究的新技術“ROCK”。該技術可以將多個相同的RNA分子組裝成一個高度組織化的結構，大大降低單個RNA分子的靈活性，並使其分子量成倍增加。

應用於具有不同大小和功能的知名模型RNA作為基準

，該團隊表明ROCK技術能夠將冷凍電鏡 （cryo-EM） 方法應用在包含RNA亞基的生物大分子的結構解析上。他們的研究結果發表在《自然-方法》上。

與廖茂富博士一起領導這項研究的尹鵬博士說：「ROCK技術正在打破目前針對RNA進行結構研究的限制，使RNA分子的近原子級解析度結構得以揭示，這一過程往往難以甚至無法用傳統的方法實現。我們期望這一進展能為基礎研究和藥物開發的許多領域注入活力，包括正在蓬勃發展的RNA療法。」

獲得對RNA的控制權

尹鵬博士的研究團隊開發了多種方法，包括

DNA磚塊和DNA摺紙術

，這些方法使DNA和RNA分子能夠根據不同的規則和需求進行自我組裝，從而形成超大分子。他們假設，這種策略也能夠將自然存在的RNA分子組裝成高度有序的環形複合物，透過將特定分子連線在一起的方式，對柔性進行限制。許多RNA以複雜但可預測的方式摺疊，在小片段之間進行鹼基配對互動。其結果往往會將穩定的 “核心 ”和 “莖環 ”向圓環外側凸出。

在ROCK技術（

透過

吻式髮夾

實現RNA寡聚化

後

冷凍電鏡

結構解析）中，目的RNA被設計成透過吻式髮夾序列（紅色）自組裝成一個封閉的同源環，這些序列定位在在功能非必要的外周螺旋上（藍色）。在確定了可編輯的非必要外周螺旋後，連線吻式髮夾模體和目的RNA核心的螺旋的長度被計算最佳化。帶有目的RNA的多個單獨亞基的RNA構建體被轉錄、組裝，透過凝膠電泳純化，並透過冷凍電鏡進行結構解析。

「在我們的方法中，我們構建了吻式髮夾，可以將同一RNA兩個複製的不同外圍莖環連線起來，使之形成一個整體穩定的環，其中包含了目的RNA的多個複製。我們推測，這些高階環可以透過冷凍電鏡進行高解析度結構解析，該技術已首次成功應用於RNA分子的結構解析。」

—劉迪，第一作者

描繪穩定的RNA

在冷凍電鏡方法中，許多生物大分子的單一顆粒在低溫下被瞬間凍結，以阻止它們的運動。隨後，在電子顯微鏡和計算演算法的幫助下，對顆粒各個方向的二維表面投影進行比較，以重建其三維結構，實現生物大分子的視覺化。彭和劉與廖和他的前研究生弗朗索瓦·塞洛（Franois Thélot）博士合作進行了該工作，後者是該研究的另一位第一作者。廖和他的團隊在冷凍電鏡領域、以及對特定蛋白質形成的單顆粒的實驗和計算分析中做出了重要貢獻。

廖茂富說

：「

與傳統方法相比，冷凍電鏡在解析包括蛋白質、DNA和RNA在內的生物分子的高解析度結構細節方面有很大的優勢，但是大多數RNA的小分子量和高柔性使其結構難以解析。我們組裝RNA多聚體的新方法同時解決了這兩個問題，透過增加RNA的分子量，並降低其柔性，我們的方法為基於冷凍電鏡方法解析RNA結構這一領域打開了大門。

」

由於整合了RNA奈米技術和冷凍電鏡方法，該團隊將這一複合技術命名為“ROCK” （RNA oligomerization-enabled cryo-EM via installing kissing loops， 透過吻式髮夾實現RNA寡聚化後冷凍電鏡結構解析）。

為了證實ROCK技術的可行性，該團隊將研究聚焦於四膜蟲（一種單細胞生物）的大內含子RNA和固氮弧菌（一種固氮細菌）的小內含子RNA，以及FMN核糖開關。內含子RNA是散佈在新轉錄RNA序列中的非編碼RNA序列，必須被 “剪接”出來才能形成成熟RNA。FMN核糖開關存在於一些細菌RNA中，這些細菌會參與由維生素B2衍生的黃素代謝物的生物合成。在與RNA結合後，黃素單核苷酸（FMN）將切換其三維構象，並抑制其母RNA的合成。

在對四膜蟲 I 組內含子的結構解析過程中，研究人員收集了約十萬張ROCK技術處理的單顆粒冷凍電鏡影象，透過一系列計算分析步驟重建了其結構，整體解析度達到了2。98，結構核心的解析度達到了2。85。最終的模型提供了四膜蟲 I 組內含子的詳細檢視，包括之前未知的外圍結構域（以土黃色和紫色顯示），它們構成了圍繞核心的條帶。

研究小組稱，他們將四膜蟲 I 組內含子組裝成一個環狀結構，使樣品更加均勻，並能夠利用組裝結構的對稱性來進行計算。雖然資料採集兩的規模並不大，但ROCK技術的優勢使研究小組能夠以前所未有的解析度解析該結構。RNA的核心結構以2。85的解析度解析，揭示了核苷酸鹼基和糖骨架結構的詳細特徵。研究小組還稱如果沒有ROCK技術加持，在當前的資源條件下，他們不可能做到這一點。

冷凍電鏡還能夠捕捉不同構象的分子。研究小組透過將ROCK方法應用於固氮弧菌內含子RNA和FMN核糖開關結構解析中，確定了固氮弧菌內含子在其自我剪下過程中的不同構象，揭示了FMN核糖開關配體結合部位的相對剛性的構象。

這項研究生動演示了RNA奈米技術如何推動著其他學科的發展。將天然狀態的RNA分子結構進行視覺化，對理解不同細胞型別、組織和生物體的生物及病理過程產生巨大的影響，甚至能夠實現新的藥物開發方法。

相關文獻摘要

高解析度的結構研究對於理解各種RNA的摺疊和功能至關重要。在此，我們提出了一種奈米結構工程策略，利用單顆粒冷凍電鏡（cryo-EM）對純RNA結構進行高效的結構測定。即ROCK技術（透過安裝吻式髮夾實現RNA寡聚化的冷凍電鏡技術）： 將吻式髮夾序列安裝到RNA的非必要功能莖上，使其自組裝成具有多倍分子量和降低結構柔性的同源封閉環。ROCK技術能夠以2。98 的整體解析度（核心部分為2。85 ）對四膜蟲 I 組內含子進行冷凍電鏡三維重構，以建立完整的RNA模型，包括以前未知的外圍域。ROCK技術被進一步地應用於兩個較小的RNA： 固氮弧菌 I 組內含子和FMN核糖開關，揭示了前者的構象變化和後者的結合配體。ROCK技術有望大大促進冷凍電鏡在RNA結構研究中的應用。

評論來源：

Science Daily

https：//www。news-medical。net/news/20220503/New-method-enables-the-structural-analysis-of-RNA-molecules。aspx

文獻來源：

Nature Methods

https：//www。nature。com/articles/s41592-022-01455-w#citeas

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https：//en。shuimubio。com/

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