1527年羅馬劫掠的舞臺靜靜地卻沒有停滯地逐漸被搭建完成，時代的風雲人物一個又一個在此地匯聚。 那時，有一個年輕的法國貴族前來拜訪曼託瓦。他是基婭拉·貢扎加與吉爾伯特·德·蒙潘西爾的兒子，伊莎貝拉的外甥查理·德·波旁。這個後來給義大利帶來深重災難的英俊貴公子，他那朝氣蓬勃的高貴精神與優雅舉止給伊莎貝拉留下了非常良好的印象。雖然他與查理八世的侄女結婚而獲得了波旁姓 氏，可是在妻子死後，他被王太后路易斯·德·薩瓦算計並擠出了宮廷。卡洛斯將他迎接到自己的身邊，讓他負責西班牙——德國聯合軍的指揮。就這樣，查理·德·波旁懷著對自己著名的伯母的深深敬愛之情離開了曼託瓦。

義大利暫時享受了一段和平時期。教皇克萊芒七世自1523年即位之際起，繼承了伯父利奧十世的政治方針， 他一方面與卡洛斯的政治手腕進行著較量，另一方面推進與弗朗索瓦一世的交涉。克萊芒七世在維持西班牙與法國兩大勢力均衡的基礎之上，謀求自身教會勢力的壯大，卡斯蒂利奧內作為教皇的特使被派至西班牙宮廷。這些舉動，讓伊莎貝拉不得不重視卡洛斯的存在。於是她將年滿17歲的第三個兒子費蘭特送到了西班牙宮廷，與以前將長子費代里科送到巴黎弗朗索瓦一世的宮廷一樣，是出於相同的想法。 伊莎貝拉·德·埃斯特一共有三個兒子和三個女兒，但她只關心兒子們，女兒們根本得不到母親的重視，儘管父親視她們為掌上明珠。長女埃萊奧諾拉因為從前的婚約而嫁給了烏爾比諾公爵，但對另外的兩個女兒，她為了節省陪嫁金而送她們進了修女院。當時，父親弗朗切斯科哭了，母親伊莎貝拉卻沒有落下一滴眼淚。三個兒子在伊莎貝拉的關心下得到了最高等的教育，茁壯成長的兒子們在大君主的宮廷裡也被認可了才能而受到重用。 當弗朗索瓦一世最終翻越阿爾卑斯 山時，在伊莎貝拉的身邊發生了一件令她悲傷不已的事情。她最疼愛的長子費代里科表現出對母親的違抗。大約20歲的時候，他戀上了一個名叫伊莎貝拉·博斯凱蒂的已婚女性。在這個情人為他生育了三個孩子之後，費代里科決定與她正式結婚。可是，他17歲的時候已經訂婚了，對方是東羅馬帝國皇帝的後裔蒙費拉託侯爵的女兒瑪麗亞，這個婚約才是伊莎貝拉所希望的。

可是，如今費代里科為了情人，在城外不遠處建造了一座美麗的宮殿，讓她居住在那裡。此外，他還向教皇請求與瑪麗亞的婚約無效。整個曼託瓦宮廷開始圍繞伊莎貝拉·博斯凱蒂這個中心運轉起來。城堡中的伊莎貝拉常常透過房間的窗戶看到華麗的年輕人們圍著伊莎貝拉·博斯凱蒂，乘坐著馬車熙熙攘攘地透過，自己身邊卻只剩下幾個老年人。兒子常常只是為了聽取意見而來，不想母親再插手國政之事。孤獨的浪潮一下子向自己撲打過 來，伊莎貝拉第一次感到自己老了，那時她51歲。 不過，她可是被人文主義學者稱為“罕見的不死鳥”的伊莎貝拉·德·埃斯特。她一點兒也沒有就此老去的想法。在人生的大海之中，她決定再一次起航。為了次子埃爾科萊能晉升為樞機主教，她再赴羅馬。1525年春，她出發前往羅馬，旅途中還在打聽著弗朗索瓦一世與皇帝軍隊的戰況。 羅馬的老朋友們幾乎都已經不在了。樞機主教畢比印納、朱利亞諾·德·美第奇、拉斐爾都死了，卡斯蒂利奧內去了西班牙。不過，教皇的秘書官薩德萊託、保羅·焦維奧、吉埃裡卡提還在。在政治情勢緊張的局勢中，教皇克萊芒七世也不能將曼託瓦棄之不顧。教皇雖然答應任命埃爾科萊樞機主教一職，可一談到具體日期，教皇卻只是顧左言右。伊莎貝拉打算在埃爾科萊戴上紅帽子之前決不離開羅馬。她每天都和朋友們一起度過，在她的沙龍里進行文藝知性的交談之餘，還常常乘坐馬車遊 覽陽光普照下的古蹟。

1526年1月，皇帝軍隊在帕維亞戰役中大敗，連弗朗索瓦一世自己都淪為俘虜，他在答應放棄對那不勒斯的法國繼承權後被予以釋放。5月，對已經強大起來的卡洛斯勢力感到恐懼的教皇發起號召，威尼斯、佛羅倫薩、米蘭和法國結成了反卡洛斯同盟。但是，曼託瓦根據伊莎貝拉從羅馬發來的指示，並沒有參加同盟。曼託瓦侯爵費代里科是教皇軍隊的總司令官，所以教皇理所當然地認為曼託瓦會加入，可是費代里科並沒有動靜。教皇想要拿出從前的誓約書，不料已經被伊莎貝拉千方百計地從梵蒂岡的金庫裡盜取了。這件事獲得了整個義大利的好評。因為，比起批評伊莎貝拉的道德（偷盜，而且是以金錢收買人員）與人性（讓兒子揹負背叛者的汙名）來說，這可是出於更為重要的政治目的的行動。 曼託瓦的費代里科也秘密地與卡洛斯交換著資訊，達成了秘密協議。雙方約定，由曼託瓦向皇帝軍隊提供軍隊及大量的軍需品，並允許皇帝軍隊借道曼 託瓦的領地。伊莎貝拉母子背叛了義大利。 當得知曼託瓦侯爵永遠都不會行動之後，教皇暴跳如雷。可是，事到如今，想要進攻曼託瓦已經是預料外的緊急事態，只能放任不管了。

9月，羅馬遭到了皇帝一方的樞機主教蓬佩奧·科隆納的襲擊。其情形被到達羅馬以來一直住在科隆納宮殿的伊莎貝拉看得一清二楚，因為科隆納軍隊就是在這個宮殿的前面集合的。教皇逃往聖天使堡，他許諾撤銷同盟。可是，當科隆納的軍隊撤回後，教皇便召來了教皇軍隊，將科隆納的軍隊驅散一清。 11月，德國——西班牙聯合軍與1。2萬名德國僱傭兵一同，在弗倫茨貝格的指揮下越過了阿爾卑斯山脈。之後不久，弗倫茨貝格患病，改由查理·德·波旁指揮。曼託瓦的費代里科接連不斷地給伊莎貝拉送去信函，請她火速回國，至少要離開羅馬。他非常擔心身在羅馬的母親的安危。可是，伊莎貝拉 待在羅馬沒動，因為皇帝軍隊的指揮是外甥波旁公爵，而且三子費蘭特也被卡洛斯委任負責皇帝的一支隊伍，再加上埃爾科萊的紅帽子還沒有到手。伊莎貝拉與其他所有人一樣完全沒有預想到半年後會發生令羅馬毀滅的恐怖事件。