公眾號：生信小課堂

研究背景：

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率都很高。肺鱗癌（LUSC）是肺癌的主要組織學型別之一，約佔所有肺癌病例的25% - 30%。近年來，免疫治療已成為一種很有前途的癌症治療策略，但只有少數LUSC患者能從免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors， ICIs）治療中獲益。因此，尋找合適的生物標誌物來預測LUSC的預後和治療反應非常迫切。單細胞RNA測序（scRNA-seq）對於靶向治療和免疫治療的發展具有重要意義（14）。近年來，scRNA-seq揭示了TME中不同的免疫細胞亞群，為定義功能性生物標誌物提供了一種新方法。鑑於這一優勢，許多研究都專注於透過整合scRNA-seq和bulk RNA-seq資料來識別新的癌症生物標誌物。

研究結果：

一、T細胞標記基因表達譜的鑑定

1、本研究中使用的scRNA-seq資料來自2個LUSC腫瘤樣本的12950個細胞。圖1A顯示了檢測到的基因數量範圍、測序深度和每個樣本中線粒體含量的百分比。

2、在對資料進行歸一化處理後，選擇了前2000個高變數基因（圖1B）。

3、採用PCA方法降維（圖1C）， 15個p 值小於0。05的樣本進行進一步分析（圖1D）。

4、從9個聚類中共鑑定了1086個差異表達標記基因。各聚類中標記基因的相對錶達量見熱圖（圖1E）。

5、使用tSNE演算法對9個聚類進行視覺化（圖1F）。

6、使用singleR演算法來註釋細胞亞群，發現簇2和簇4被定義為T細胞亞群（圖1G）。

二、預後模型的構建與驗證

1、 LASSO分析確定了基於最佳lambda值的8個T細胞marker基因和相應的係數（圖2A， B）。

2、多變數Cox迴歸分析得到BTG1、JUND、IER3、ZNF331、PSAP 5個基因（圖2C）。

3、根據中位TCMGrisk（中位TCMGrisk =0。973）將患者分為高危組和低危組。TCMGrisk的散點圖顯示，隨著TCMGrisk評分的增加，OS降低，而死亡率上升（圖2D-I）。

4、與低危組相比，高危組的生存期明顯更長（P小於0。001）（圖2J）。

5、1年、3年和5年訓練佇列的AUC分別為0。614、0。713和0。702（圖2M）。

6、試驗佇列結果顯示，低危組OS優於高危組OS （P=0。015）（圖2K）。1、3、5年的AUC分別為0。669、0。603、0。645（圖2N）。GEO佇列結果顯示，低危組OS優於高危組（P=0。030）（圖2L）。1年、3年和5年的AUC分別為0。661、0。628和0。590（圖2O）。

三、特徵基因的差異表達

1、與正常患者相比，luc患者IER3表達上調，而JUND、PSAP和ZNF331表達下調。

2、利用HPA資料庫的免疫組化結果進一步評估特徵基因在LUSC中的表達。IER3蛋白顯著高表達LUSC組織，抗體染色強，染色細胞多。而JUND和PSAP蛋白在正常組織中顯著高表達。

四、諾姆圖的建立與決策曲線分析

1、透過綜合臨床因素和TCMGrisk構建諾姆圖，分別預測LUSC患者1、3、5年的生存機率（圖3A）。

2、標定圖顯示，觀測值與預測值高度一致（圖3B）。

3、AUC結果顯示nomogram在預測1、3、5年預後方面具有更高的臨床淨效益（圖3C E）， DCA顯示nomogram在預測1、3年OS時具有最佳的臨床淨效益，而在預測5年OS時則沒有（圖3F-H）。

五、基因集合富集分析

1、高危組非小細胞肺癌通路富集（圖4）。由於這些生物通路與免疫相關，並參與腫瘤免疫，進一步分析免疫，比較兩組間的差異。

六、腫瘤免疫微環境和免疫相關基因的估計

1、免疫相關的高危組功能更活躍（圖5A）。

2、相關分析顯示，TCMGrisk與免疫評分、間質評分呈正相關（圖5B、C）。

3、ESTIMATE演算法結果顯示，高危組間質評分、免疫評分、估計評分均顯著高於高危組（P小於0。001）（圖5D）。

4、ssGSEA演算法結果發現高危組中T細胞CD4記憶靜息、NK細胞啟用、樹突狀細胞靜息、中性粒細胞高表達（圖5E）。

5、PD-L1、CTLA-4、IDO1、PDL2、TIM-3、LAG-3、TIGIT在高危組中呈高表達，而PD-1在兩個高危組中表達差異無統計學意義（圖5F）。

6、高危組HLA相關基因表達水平均較高（圖5G）。

七、基因突變分析

1、LUSC的總體突變概況如圖6A所示。

2、圖6B顯示了基因突變之間的相互作用，大多數基因之間的突變是同時發生的（P小於0。05）。

3、TP53、TTN和CSMD3是低危組和高危組中突變頻率最高的基因（圖6C、D）。

4、TMB表達水平在兩危組間無差異（P=0。19）（圖6E）。

5、K-M曲線顯示，高TMB組的預後優於低TMB組（P小於0。001）（圖6F）。

6、結合模型後，低危+高TMB組的預後明顯好於高危+低TMB組（P小於0。001）（圖6G）。

八、藥物敏感性分析

1、進一步探討低危組和高危組化療藥物IC50水平的差異（圖7A-L）。TCMGrisk可作為抗癌藥物選擇的預測因子。

總結：

免疫療法已成為治療癌症的一種強有力的臨床策略。最近，隨著ICIs的陽性結果，人們對肺癌的免疫治療重新產生了興趣。然而，探索能從免疫治療中獲益的LUSC患者仍然是一個巨大的挑戰。目前的研究表明，scRNA-seq技術是探索腫瘤異質性和不同細胞亞群的強大工具，這對確定潛在的治療靶點很重要。在本研究中，進行了scRNAseq分析，以探索LUSC中的T細胞標記基因，並使用訓練佇列構建預後特徵。試驗和GEO佇列被用於進一步評估簽名的預測能力。此外，本研究發現高危組的免疫評分、基質評分、免疫細胞浸潤、免疫檢查點和體細胞突變水平較高。在高危組中，更多的免疫相關通路也被富集。