過敏性哮喘是常見的由多種細胞及細胞組分參 與的氣道慢性炎症性疾病，全球多達 3 億人受到影 響，發病率逐年上升且臨床治療效果不佳［1］。其主 要特徵是血清 IgE 和細胞因子水平升高、氣道嗜酸 性粒細胞增多、粘液積聚、氣道高反應性及可逆的氣 道重塑［2－3］。肺泡巨噬細胞作為肺部微環境中數量 最多的炎症細胞參與病原體的識別、攝取和殺傷，在 機體炎症反應的啟動和調節以及適應性免疫中起著 重要作用 4 － 5 。脂多糖（ Lipopolysaccharide，LPS） 是 革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分。研究表明，LPS 可以刺激巨噬細胞中炎性介質及炎性細胞因子（ 如

NO、TNF-a和ILE、L40）的分泌，從而導致肺損傷 和氣道重塑加劇，加重炎症反應［7］。 因此， LPS 刺激 巨噬細胞被廣泛應用於研究過敏性哮喘等炎症性疾 病。

草烏甲素（ Bulleyaconitine A， BLA） 是一種從烏 頭屬植物中分離的二萜類生物鹼，據報道具有抗炎、 鎮痛及免疫調節等生物學活性［8 －9］。 我們前期研究 結果表明草烏甲素可緩解過敏性哮喘小鼠的氣道炎 症反應，但其具體的分子機理尚不十分清楚。 鑑於 此，本研究擬以LPS刺激小鼠巨噬細胞RAW264。 7 為炎症模型，旨在從細胞水平上進一步闡明草烏甲 素的抗炎機制，從而為草烏甲素對過敏性哮喘的治 療提供更多實驗依據。

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材料與方法

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材料

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主要材料與試劑

小鼠腹腔巨噬細胞系 RAW264。7 由皖南醫學 院中心實驗室贈與； 草烏甲素標準品（ BLA） （ 編號 CAS#107668-79-1 ） 購自上海源葉生物科技有限公 司； 脂多糖（ LPS） （ 編號 L2880-O55： B5） 購自美國 Sigma 公司； DMEM 完全培養液購自美國 Gibco 公司 （ 編號 REF： C11965500BT） ； CCK-8 細 胞活力 /毒性 檢測試劑盒購自合肥睿捷生物科技有限公司（ 編號 ref： BL001B） ；IL-6>IL-1 0、TNF-x 和 MCP-1 ELISA 檢測試劑盒（ 編號分別為 REF： AE90247Mu； REF： AE90731Mu； REF： AE90301Mu； CSB-E07430m） 購自 美國 Amresco 公司； 兔 抗 iNOS、 COX-2、 TLR4、 NF- kBp65、 p38MAPK、 ERK 和 JNK 等多克隆抗體（ 編號 分 別 為 13120S、 12282S、 D220102-0100、 8242S、 8690S、4695S、9252P） 購自美國 Cell Signaling Technology 公司。

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主要儀器裝置

超淨工作臺（ 型號 SJ-CJ-2D） 為上海尚淨公司 產品；CO2細胞培養箱為日本SANYOMCO公司產 品；倒置顯微鏡（ 型號 IX73） 為日本 OLYMPUS 公司 產品； 多功能酶標儀（ 型號 Tecan Infinite F200） 為瑞 士 TECAN 集團公司產品；低溫高速離心機（ 型號 3- 18KS） 為美國 Sigma 公司產品； 恆溫水浴鍋（ 型號 HH-3） 為江蘇金壇市億通電子有限公司產品。

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方法

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細胞培養

RAW264。 7細胞於37°C、％ CO2以及95%相對 溼度的培養箱中孵育，用含 10% 胎牛血清（ FBS） 、 1%雙抗（ 青黴素和鏈黴素） 的 DMEM 完全培養液培 養。 每隔1 天換液 1 次，待細胞鋪滿培養皿進行傳 代或凍存。 取對數生長期細胞進行實驗。

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細胞活性檢測

將對數生長期的 RAW264。7 細胞製備成細胞 懸液，加入6孔板，每孔100咽細胞懸液，待細胞融 合度達80%時，分別使用不同濃度的草烏甲素（ 0、 25、50、100、150、200、400、600、800、1 000、500 隅/ mL） 處理細胞，培養 24 h 後棄去培養液，將 CCK-8 溶液與DMEM完全培養液按1： 10的比例稀釋後， 每孔加入100 稀釋液，避光在培養箱中繼續孵育 2 h 後終止培養，使用酶標儀測定在450 nm 處的吸 光度（ OD） 值。

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不同草烏甲素作用時間細胞上清液中炎症 因子的檢測

將對數生長期的 RAW264。7 細胞製備成細胞 懸液，加入 6 孔板，每孔 2 mL。 待細胞融合度達 80%時用150隅/mL的草烏甲素預處理細胞2 h， 然後每孔加入 500 ng/mL 的 LPS 刺激細胞，在草烏 甲素作用 時間分別為 0、0。 5、1、2、3、4、5、6、8、12、 16、18、20、24、30、48 h 時終止培養並收集細胞上清 液，用ELISA試劑盒檢測ILE、IL40、TNF-x和 MCP-1 含量，具體操作按照說明書進行。

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Western blot 檢測草烏甲素對 LPS 誘導的 RAW264。7 細胞訊號通路的影響

處理方法同上，在草烏甲素作用時間分別為 0、

2、 6、12、18、24 h 時終止培養，收集細胞並提取總蛋 白 － 20C 儲存備用。 取等量樣品行 SDS-PAGE 電 泳，溼轉至NC膜；5%BSA封閉2 h，一抗4C孵育過 夜，TBST洗膜3遍，每遍10 min；二抗孵育40 min， TBST 洗膜 3 遍，每遍 10 min， ECL 發光試劑盒曝光 成像。

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統計學分析

所有資料均以均數土標準差（x ± s）表示，採用 SPSS20。 0 進行資料分析，多組間比較採用單因素方 差分析（ One-way ANOVA） ，兩兩比較採用 SNK 法。 PW 0。 05

表示結果有統計學意義。

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結果

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草烏甲素對 RAW264。 7 細胞活力的影響

CCK-8 結果（圖 1）表明 25、50、100、150 隅/mL 的草烏甲素作用於 RAW264。 7 細胞 24 h 對其活力 沒有顯著影響，而 200、 400、 600、 800、 1 000、 1 500 隅/mL的草烏甲素作用於細胞24 h對其增殖活力 有顯著的抑制作用，因此後續實驗使用150隅/mL

TNF-a含量均降低（P < 0。01 ），其中30 h組與其 他各小時組相比含量最低（ P < 0。 05） ，而 30 h 組 與48 h組相比差異無統計學意義（P > 0。05 ）；圖 2B 顯示：與 LPS 組相比，草烏甲素作用各時間段 IL- 10 含量均降低（ P < 0。 01） ，其中 5 h 組與 6、16、 18、 20、 30、 36 h 組 相 比 IL-10 含量 更低 （ P < 0。 05） ；圖 2C 顯示與 LPS 組相比，除3、4 、16 和 20 h 差異無統計學意義外，其他各作用時間段IL-6含量 均降低（ P < 0。 05） ；圖 2D 顯示與 LPS 組相比，除 0。 5h 和 2 h 差異無統計學意義外，其他各作用時間 段 MCP-1 含量均降低（ P < 0。 05） 。

2. 3

草烏甲 素對 LPS 誘導的 RAW264。 7 細胞中 iNOS 和 COX-2 表達水平的影響

在本研究中，透過 Western blot 檢測 iNOS 和 COX-2 的表達。 結果顯示，與對照組相比， LPS 顯著 增加iNOS和COX-2的表達。然而，用150隅/mL 的草烏甲素分別處理細胞 2、6、12、18、24 h 均可降 低 iNOS 和 COX-2 的表達（ P <0。 01） ，其中與其他各 作用時間組相比草烏甲素作用時間 48 h 抑制效果 最好（ 圖 3） 。總之，結果顯示草烏甲素可以抑制 LPS 誘導的 RAW264。 7 細胞中 iNOS 和 COX-2 的表 達水平。

2. 4

草烏甲素對 LPS 誘導的 TLR4 和 NF-kB 通路 活化的影響

透過 Western blot 檢測 TLR4 和 NF-kBp65 的表 達。 結果顯示，與對照組相比， LPS 顯著增加 TLR4 的表達以及NF-

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草烏甲素對 LPS 誘導的 MAPK 通路活化的影響 透過 Western blot 檢測 BLA 對 MAPK 通路活化 的影響。結果顯示LPS顯著增加p38、細胞外受體 激酶（ ERK） 和 c-Jun-N 末端激酶（ JNK） 的磷酸化。 然而，用草烏甲素分別作用於細胞 2、6、12、18、24 h 抑制了 p38、ERK 和 JNK 的磷酸化，其中與其他各 作用時間組相比草烏甲素作用時間 48 h 抑制效果 最好（ 圖 5） 。總之，結果顯示草烏甲素可有效抑制 LPS 誘導的 RAW264。 7 細胞中 MAPK 訊號通路的活 化。

3

討論

巨噬細胞作為先天免疫的第一道防線，在炎症 的發生發展和消除中起關鍵作用；其透過在病原體 入侵時釋放細胞因子和炎症介質引起先天免疫反 應［10］。炎症期間，活化的巨噬細胞產生過量的炎症 介質（如NO和TNF-a）以及炎性細胞因子（如IL40 和 IL-6） ，這些物質透過與其他炎症介質的協同作用 促進過敏性哮喘等炎症性疾病的發生與發展［11］。 因此，巨噬細胞廣泛用於炎症和免疫的研究中。

草烏 甲 素 （ Bulleyaconitine A， BLA） ，一 種分離 自烏頭屬植物的二萜類生物鹼，目前對於 BLA 生物 學活性的研究主要集中在鎮痛方面［12］。研究發現， BLA可減輕紫杉醇誘導的大鼠脊髓背角C-千維突 觸的神經病理性疼痛［13］；另有研究表明 BLA 透過 抑制蛋白激酶 C（ PKC） ，減少神經病理性大鼠未損 傷的背根神經節神經元中對河豚毒素敏感的鈉電 流，從而緩解疼痛［14］。此外， BLA 透過直接刺激脊 髓小膠質細胞中強啡肽 A 的表達表現出抗過敏反 應［15］。而據最新研究報道 BLA 可緩解過敏性哮喘 小鼠的氣道炎症反應［16］，但其潛在的抗炎分子機理 尚不十分清楚。

本研究首先採 用 CCK-8 檢測 了 BLA 對 於 RAW264。 7 細胞活力的影響，結果顯示 BLA 在小於 等 於150 Rg/mL時沒有細胞毒性，因此後續實驗使 用150 Rg/mL的BLA處理細胞。受刺激的巨噬細 胞分泌大量的炎症介質，包括促炎細胞因子（ 如 IL- 6、IL-TNF-a）和單核細胞趨化蛋白-（MCP-）， 導致炎症細胞浸潤到氣道炎症中，並導致多種免疫 紊亂［17－18］。本課題透過檢測不同 BLA 作用時間細 胞上清液中IL-6、L40、TNF-a以及MCP-1的水平 發現，BLA作用不同時間均可下調它們的水平，其 中BLA在作用時間48 h時對TNF-a的抑制效果最 明顯。在炎症過程中，由誘導型一氧化氮合酶（ iN- OS） 產生的 NO 自由基在感染的先天免疫反應中起 重要作用［19］； 哮喘等炎症性疾病發生時 iNOS 表達 通常升高［20］。環氧合酶-2 （ COX-2） 是炎症介質前 列腺素（ PG） 和白三烯等生成過程中的關鍵酶，這些 炎症介質引起機體紅腫熱痛和炎症細胞浸潤，從而 加重現有的炎症［21－22］。因此，抑制 iNOS 和 COX-2 對減輕氣道炎症很重要。在本研究中， LPS 組的 iN- OS 和 COX-2 表達顯著高於對照組。然而，用 BLA 處理顯著降低了 iNOS 和 COX-2 表達水平，其中 BLA 作用 48 h 抑制作用最好。研究證實， NF-kBp65 作為轉錄因子 NF-kB 家族的其中一員，在炎症性疾 病中過度啟用，如過敏性哮喘［23 －24］。絲裂原活化蛋 白激酶（ MAPK） 家族包括 3 個成員： 細胞外訊號調 節激酶 1 /2 （ERK1 /2），p38MAPK 和 c-Jun N■末端激 酶（JNK）飼。NF-kB及MAPK作為典型的炎症信 號通路，它們能夠調節 iNOS 的轉錄以及相關促炎 細胞因子（包括TNF-a、LJ0和ILE等）的表達，並 在炎症反應中與COX-2相互作用125 - 27］。LPS可通 過 toll 樣受體 4（ TLR4） 訊號通路啟用 NF-kB 及 MAPK 通路，誘導炎性細胞因子的產生，從而加重炎 症［28］。另一方面，據報道 MAPK 的磷酸化和活化可 促進 NF-kB 的 活 化、 核轉運和隨後的轉錄調 節［29－30］。因此，在本研究中，我們檢測了 BLA 對 LPS 刺激的 NF-kB 和 MAPK 通路活化的影響。結 果顯示，與對照組相比， LPS 刺激可增加 RAW264。 7 細胞 TLR4 的表達以及 p65、p38、ERK、JNK 的磷酸 化； 而 BLA 處理可降低 TLR4 的表達並降低 p65、 p38、ERK、JNK 的磷酸化。這些結果表明， BLA 可能 透過抑制 NF-kB 和 MAPK 通路的活化減少炎症細 胞因子的產生來發揮抗炎作用。

綜上所述，本研究透過細胞實驗證明草烏甲素 能夠抑制 LPS 誘導的 RAW264。 7 細胞炎症反應，其 機制可能是透過抑制 TLR4、NF-kB 及 MAPK 訊號通 路的活化，從而減少 iNOS、COX-2 和促炎細胞因子 的表達實現的。因此，我們的研究為草烏甲素治療 過敏性哮喘等炎症性疾病提供了實驗依據，為進一 步研究草烏甲素的抗炎機制奠定了基礎。