今天我們將介紹一種古老而又經典的病毒檢測方法——半陣列織培養感染劑量（TCID50）。

關於TCID50

1954年， J。 F。 Enders 首次提出了基於細胞培養體系的動物病毒分類方法，TCID50法是利用不同稀釋度的病毒液接種宿主細胞後，能使50%宿主細胞出現病變效應（CPE）的病毒量來確定病毒滴度。

這種檢測方法的優點是成本低，而且在沒有病毒特異性抗體的情況下也易於實施。事實上，無需瞭解太多病毒自身資訊，就可以利用它作為研究新出現的病原體的關鍵工具。

TCID50法測試病毒滴度

TCID50試驗：它是什麼？如何使用它？

在TCID50試驗中，將病毒液進行梯度稀釋，並將其接種到單層宿主細胞上，並放置在CO2培養箱中直至發生細胞病變。此時，病毒梯度稀釋液對宿主細胞的影響可以用直接或間接的方式進行評定。

直接方式

，以50%宿主細胞顯示病變的單一稀釋度來近似定量原液中存在的病毒量。這相當簡單直接，不需要進一步分析。然而，這也有一定程度的不確定性，因為它不能在同一稀釋液中重複準確檢測。

透過使用比色分析，

間接方式

可以獲得更準確的資訊，例如某些具有特定吸光度的代謝底物，其中獲得的訊號與活細胞的數量成正比。不同稀釋度與其吸光值可以繪製成一個連續的非線性迴歸劑量-響應曲線，從中可以推測出更準確的TCID50值。

如果不需要精確的滴度，或在後續試驗中獲得一定百分比的細胞感染需要多少濃度的病毒，則直接方式就足夠了。然而，在這種的情況下，最好使用1：2和1：5之間的稀釋倍數來提高準確性。當需要更準確的定量時，例如當比較不同處理或突變對病毒滴度的影響時，可以優選比色法。

MTT比色法

從稀釋到滴度確定

TCID50值表明，使50%的細胞發生病變需要多少病毒。但是如何從這個值得到每毫升的實際病毒量？這個公式非常簡單，它是將TCID50值乘以0。7。由於病毒感染宿主細胞是一種隨機事件，遵循Poisson分佈，在完全被允許的作用細胞系中，達到50%感染的機率的感染複數（一個系統中感染病毒的細胞數和總細胞數之比，MOI）約為0。7。雖然這並不一定準確，但它基本適用於大多數的病毒滴度估算。

腺病毒病毒粒子

病毒計數絕非易事

首先，梯度稀釋本身就是誤差的來源，在高滴度的病毒液中影響尤為重大，即使是附著在移液器吸頭末端的非常小的體積也可以攜帶足夠的病毒顆粒，從而在定量方面產生實質性的差異。其次，系統的生物學差異很大，雖然加入相同數量的細胞，加入相同數量的病毒，同時終止感染，感染百分比只可能相近，但絕不會完全相同。最後，在評估減少病毒滴度的處理方法時，病毒量可能低於試驗檢測閾值。

病毒計數是一門藝術

一旦你知道你的問題在哪裡，那麼離解決方案不遠！

梯度稀釋可以透過自動化來提高準確性，當硬體不滿足時，下面一些小技巧可以起到作用。例如，及時更換移液器吸頭，不要將移液器槍頭插入下一梯度稀釋液中，以避免帶入一些粘附在吸頭外部塑膠上的多餘病毒。試驗復孔設計也很重要，小型化檢測中更是如此。96孔板允許同時處理多個樣本，但它具有更多的不確定性，因為小體積對上述問題更為敏感。

透過3個復孔比色分析測定TCID50，可以增加該方法的可靠性，並允許排除資料中的虛假點而不至於失去意義。準確的TCID50值將需要透過比色資料的非線性迴歸劑量-響應曲線從而推算得到。建議結合目視檢查曲線和比色資料的曲線推算得到TCID50值，以糾正因虛假資料點存在而推算誤差的情況。

最重要的是，我們的經驗表明，除了標準的病毒滴定方法之外，需要最佳化其他相關步驟得到準確的TCID50，確定最佳系統條件（例如選擇的細胞系，平板形式，感染複數，時間點等），確保上游收集可重複的病毒數量，以及在TCID50測定中測試的最佳濃度範圍（例如起始濃度和稀釋倍數）。

病毒計數迎來新挑戰

計數死細胞並不容易，因為它們經常在第一次清洗時脫離細胞板-即使它們仍然在先前的位置，這對我們試驗的準確性毫無幫助。只要有好的抗體可用，雖然更昂貴、更麻煩，但是免疫熒光染色是通常選用的方法。該檢測可在細胞死亡前結束，靈敏度一般較高，因此更容易控制，精度更高。此外，這種方法可以用於不會引起細胞CPE的病毒，或者需要很長時間才能做到引起CPE。

引起細胞病變是我們所知道的大多數感染性病毒和少數幾種新出現的病毒的特徵。目前也已經有一些顯色劑/熒光染劑可以敏感地檢測和區分不同型別的細胞毒性。看來這個古老而又經典的方法正在迎接新的挑戰！

直接免疫熒光法測抗原