點選上面

“藍字”

關注我們！

今天推送的文章是捷克科學院生物技術研究所的

Svecova Leona

教授團隊於

2021

年

4

月份在

Acta Crystallographica Section D-Structural Biology

期刊上發表的

Crystallographic fragment screening-based study of a novel FAD-dependent oxidoreductase from

Chaetomium thermophilum

。

嗜熱毛殼菌

FAD

依賴性氧化還原酶（

CtFDO

）是葡萄糖

-

甲醇

-

膽鹼（

GMC

）氧化還原酶超家族中的一種新型耐熱糖蛋白。然而，

CtFDO

對該家族的典型底物沒有活性，對約

1000

個化合物的高通量篩選沒有選到合適的底物。因此，蛋白質結晶學，包括

42

個晶體片段和

37

個其他化合物的晶體學片段篩選，被用來描述

CtFDO

的配體結合位點並表徵其底物的性質。

CtFDO

的結構揭示了一個異常開放的活性口袋，其獨特的

His–Ser

氨基酸對可能參與酶催化。

CtFDO

複合物的六個系列晶體結構揭示了五個不同的位點，用於結合活性位點口袋內的芳基，以及在適應特定配體時相互作用的氨基酸的構象靈活性。該蛋白質能夠結合分子量大於

500 Da

的複合多環芳烴底物。

低分子量片段的晶體學篩選是定位靶蛋白結合位點和識別與靶蛋白特異性相互作用的化學基團的有效方法。該方法的通常目的是利用這組結合片段作為新藥設計的起點。然而，它也有潛力用於未知底物結合位點的表徵和酶功能的預測。

該酶在米麴黴中成功表達並純化。首先透過

LC-MS/MS

光譜法驗證了

CtFDO

的特性，與預期的成熟酶序列相比，確認了

595

個氨基酸殘基，並在

N

端發現了

20

個缺失殘基，在

C

端發現了

8

個殘基。

CtFDO

包含

GMC

氧化還原酶超家族的

GlyX-Gly-X-X-Gly

序列基序（

Gly32–Gly37

）和

C

端活性位點組氨酸（

His564

）特徵。

如質量光度法所示，

CtFDO

在溶液中是單體形式，其分子量約為

85 kDa

，

MALDI-TOF

光譜也證實了這一點。

MALDI-TOF

光譜中約

85 kDa

的寬峰表明可能存在糖基化的異質性。將光譜與脫糖基形式的

CtFDO

的光譜進行比較，顯示脫糖基後質量損失約

17 kDa

。

結晶的

CtFDO

是一種分子量約為

68 kDa

的單體。遊離晶體結構在不對稱單元中有兩個

CtFDo

分子（鏈

A

和

B

），

C

α

原子的

rmsd

為

0。12

埃。兩種單體中的

N-

端殘基

42–45

和

C-

端殘基

631–636

均缺乏清晰的電子密度，因此未進行建模。

CtFDO

包含一個二硫鍵：兩個序列相鄰的半胱氨酸殘基之間的反式鄰位二硫鍵（

Cys566

和

Cys567

）。

CTFD

晶體結構證實了

CtFDO

中存在六個

N-

糖基化位點（位於

Asn114

、

Asn182

、

Asn197

、

Asn295

、

Asn374

和

Asn543

）。

Asn46

的第七個糖基化位點在結構上不確定，但透過

MALDI-TOF

肽質量指紋圖譜證實。

CtFDO

包含一個漏斗狀的大開口活性口袋，

FAD

異四氧嘧啶環從一側伸入袋中。輔因子透過氫鍵與

13

個周圍殘基（

Ile56

、

Ser57

、

Glu77

、

AL78

、

V al124

、

Gly128

、

Asn132

、

Ala133

、

V al135

、

Val273

、

Ile597

、

Ser607

和

Met609

）非共價結合到蛋白酶，並透過

12

個水分子間接結合。

CtFDO

在異四氧嘧啶環的表面上含有四個殘基，即

Asn562

、

Ala563

、

His564

和

Ser607

。

His564

在

CtFDO

中的位置與保守的活性位點組氨酸殘基相對應，組氨酸殘基在大多數

GMC

氧化還原酶的還原半反應中起催化作用。

His564

咪唑環的方向透過與

Gln351

的氫鍵穩定。

His564

與位於

FAD

異四氧嘧啶環嘧啶部分附近的

Ser607

形成

His–Ser

對。

複合物晶體表明，單個化合物有五個結合位點：催化位點（

CS

）和其他四個標記為

S1–S4

的位點。

CS

被放置在

FAD

異四氧嘧啶環、

Ala133

、

Tyr476

、

Asn562

、

Ala563

、

His564

和

Ser607

形成的口袋的狹窄通道中。

CS

的殘基偶爾以兩種不同的構象出現，以適應結合的化合物。

S1

是活性口袋的最深部分，它被

CS

的殘基部分分離，形成空腔。

S1

主要由疏水殘基（

V al135

、

Leu137

、

Lys231

、

Ile237

、

Gln351

、

Ile403

、

V al405

、

Thr464

、

His466

、

Leu474

、

Leu478

和

Gly606

）形成，在中性

pH

下具有顯著的正靜電電位。

S2

位於附近，由

V al135

、

Ile237

和

His466

構成。剩下的兩個位點位於隧道邊緣。

S3

是由

Val117–Ile120

、

Tyr501

和

Asn559

–

Ser561

建立的淺空腔；

S4

由芳香殘基

Phe94

、

T rp97

和

Phe100

以及

Pro96

組成。除了

S1–S4

之外，還可以確定另一個可能用於底物結合的位點

S5

。它位於由

Thr368

、

Asp369

和

Gly468–Ser471

肽形成的活性口袋的入口，為相互作用提供許多親水性接觸。在當前的結構中，它充滿了水。

在

CtFDO：MAMB

複合物中，

CtFDO

在

CS

中結合了一個

MAMB

分子，在

S1

中結合了一個甲酸分子

（

結晶條件

）

。

MAMB

與

Tyr476

氫鍵結合，

MAMB

透過範德華力和黃素、

Ala133

、

Leu399

、

Tyr476

和

Asn562

的相互作用進一步穩定。甲酸分子透過氫鍵與兩種構象中的

Thr464

、

Ser607

相互作用，並透過水分子與

Gln351

相互作用。在

CtFDO：PESB

複合物中，每個蛋白質鏈結合一個

PESB

分子和一個甲酸分子。

PESB

透過氫鍵與

Asn562

相互作用，透過範德華力與

FAD

、

Ala133

、

Val135

、

Leu399

、

His466

、

Leu474

、

Tyr476

和

Asn562

的相互作用。在

CtFDO：IPEA

複合物中，每個蛋白質鏈結合一個

IPEA

分子。

IPEA

透過氫鍵直接與

Asn562

和

Tyr476

相互作用，也透過水分子與

Asn562

相互作用。

在

CtFDO：4NC

複合物中，兩條

CtFD

鏈結合兩個

4NC

分子，一個在

S1

中，另一個在

S3

中。第一個

4NC

分子主要透過範德華力相互作用（

Leu137

、

Lys231

、

Phe235

、

Gln351

、

Ile403

、

V al405

、

Thr464

、

T yr476

、

Leu478

、

Asn562

、

His564

、

Gly606

和

Ser607

）以及

Gln351

和

Asn562

的氫鍵來穩定。後一個

4NC

與

Ser561

、

Ala563

和

Asn559

氫鍵結合，並透過水分子與

Ser561

、

Gln565

和

Ile120

相互作用。在

CtFDO：4NP

複合物中，

CtFDO：4NP

結構的兩個單體在

S1

中結合一個

4NP

，第二個

4NP

分子結合在活性口袋的入口（其羥基位於

S3

，硝基位於

S4

）。

4NP

與

Ser561

形成氫鍵，並透過水分子與

Asn559

進一步相互作用。它還透過範德華力與

Phe94

、

Pro96

、

Ile120

、

Ser561–Ala563

肽和黃素的相互作用而穩定。

在

CtFDO：ABTS

複合物中，每個單體在活性口袋中結合一個

ABTS

分子。一個

ABTS

硫酸鹽部分結合在

CS

中，取代活性部位水。

ABTS

與黃素、

Asn562

、

His564

、

Ser607

和對稱鏈

B

的

Arg628

形成氫鍵。它透過水分子與

Gln351

、

Asn397

、

Ser398

、

Asn562

、

Ser607

以及對稱鏈

B

的

Asp621

進一步相互作用。

ABTS

還透過範德華力與

Phe94

、

Pro96

、

T rp97

、

Ala133

、

Val135

、

Ser398

、

Leu399

的相互作用而穩定。

CtFDO

的晶體結構分析表明，這種具有目前未知底物的新型酶保留了

GMC

氧化還原酶超家族的典型摺疊，增加了幾個額外的螺旋，並具有一個非典型的大而寬的開放活性位點通道。

His564

被認為是一種通用的鹼基，

Ser607

與

Asn562

和

Tyr476

一起參與底物結合。晶體學片段篩選的結果顯示，小的無機和芳香基團結合在通道的幾個亞基中，表明酶底物的複雜多芳烴性質對應於較大的木質素成分。

整理

：

閆亞茹

文章資訊

：

DOI： 10。1107/S2059798321003533

文章連結

： https：//scripts。iucr。org/cgi-bin/paper？S2059798321003533