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2021年6月28日，中國科學院腦科學與智慧技術卓越創新中心竺淑佳研究員團隊在Cell Press細胞出版社期刊Neuron上發表了一篇題為“Gating mechanism and a modulatory niche of human GluN1-GluN2A NMDA receptors”的新論文，研究了人GluN1-GluN2A NMDA受體的門控機制和調節位點。

摘要

N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體是穀氨酸（Glu）門控的鈣高通透離子通道，對突觸傳遞和突觸可塑性起到重要調節作用。在此，我們報道了一系列人源GluN1-GluN2A亞型NMDA受體與不同小分子結合的冷凍電鏡（cryo-EM）結構，總體解析度達4。在全長GluN1-GluN2A受體的電子雲密度圖中，我們可以直接觀察到結合在GluN1和GluN2A亞基配體結合域（LBD）上的競爭性拮抗劑。同時我們發現，正向變構調節劑（PAM）的結合縮短了LBD和跨膜結構域（TMD）之間的距離，從而進一步使得門控通道處於開放狀態。最有意思的是，我們出乎意料地在LBD-TMD連線區域發現了9-氨基吖啶的結合腔，與傳統的NMDA受體通道阻斷劑結合位點完全不同。我們的研究為LBD和TMD在通道啟用、抑制和變構中的構象轉換機制提供了結構資訊。

作者專訪

Cell Press細胞出版社特別邀請論文作者竺淑佳研究團隊進行了專訪，請他們為大家進一步詳細解讀。

CellPress：

NMDA受體在突觸前和突觸後功能有什麼差異？

竺淑佳團隊：

NMDA受體廣泛存在於興奮性突觸後膜上，領域內對突觸後膜上NMDA受體的研究較為深入，但是對突觸前膜上的NMDA受體功能研究甚少。有研究發現突觸前膜的NMDA受體可以在突觸前起到高通濾波的作用，參與突觸後膜電位的調節。突觸後的NMDA受體接受突觸前釋放的神經遞質（穀氨酸），同時結合突觸間隙中游離的甘氨酸來啟用通道，以此將化學訊號轉變為電訊號，廣泛參與突觸訊號傳遞和突觸可塑性。

CellPress：

GluN1-GluN2AWT和GluN1-GluN2AEM受體的生物物理特性有什麼差異？

竺淑佳團隊：

GluN1-GluN2AEM和GluN1-GluN2AWT相比在配體結合域二聚體介面之間引入了一對半胱氨酸的突變，突變後的受體在通道的開放機率和動力學特性都有一定程度的提高。換句話說，該受體就處於一個更加啟用的狀態。同時我們在GluN1-GluN2AEM受體上截短了C末端結構域來保證受體蛋白純化時的穩定性，透過電生理實驗發現，截短C末端後與野生型受體相比，通道展現更快的脫敏現象。

CellPress：

為什麼選擇了CPP，CGP-78608，GNE-6901和9-AA進行研究？這些物質在GluN1-GluN2A受體上的作用位點有何不同？

竺淑佳團隊：

這些小分子的選擇是為了解答GluN1-GluN2A亞型NMDA受體在不同生理學狀態下的構象差異。如CPP和CGP-78608分別為NMDA受體GluN2A和GluN1配體結合域的競爭性抑制劑，透過競爭性抑制激動劑來模擬受體處於一個抑制關閉的狀態。

GNE-6901是Genentech公司開發的靶向GluN1-GluN2A受體的特異性正向變構調節劑。透過冷凍電鏡解析的全長GluN1-GluN2A NMDA受體結構，我們透過全長結構解析發現GNE-6901結合在GluN1和GluN2A二聚體中間（與之前的晶體學結構解析的結合位點一致）。但我們從全長受體的構象變化上說明了正向變構調節劑如何使得門控通道進一步處於相對開放狀態。

9-AA的結合區域解析是我們最有趣的發現。9-AA在此前的研究發現中是一種可以將通道鎖定在開放構象的通道抑制劑，但是對於其結合位點一直沒有直接的證明。我們的研究發現9-AA結合在配體結合域和門控通道之間的鉸鏈區域，該區域此前從未有小分子結合報道。我們透過電生理實驗驗證了在鉸鏈區的一對穀氨酸的突變會影響9-AA的作用。這個新小分子結合位點的發現豐富了NMDA受體的藥理學研究。

CellPress：

正向別構調節劑（PAM）結合全長GluN1-GluN2A受體後對門控通道產生了什麼效應？其分子機制如何？

竺淑佳團隊：

此前的研究發現，GNE-6901小分子透過作用在由GluN2A亞基組成的NMDA受體上，可以促進CA1錐體神經元的興奮性突觸後電位進而改善腦部功能。冷凍電鏡解析的GNE-6901結合的GluN1-GluN2A受體結構分析發現，小分子結合在GluN1與GluN2A亞基配體結合域間二聚體中，同時使得配體結構域的D2 lobe進一步向外開啟，這種變化同時也透過鉸鏈區傳導到跨膜區，使跨膜區整體向上移動，進而讓受體的門控通道處於更加開放的構象。這也是首次在全長NMDA受體上觀察到GNE-6901的變構調節機制。

CellPress：

本研究在LBD-TMD連線區域發現了一個9-AA的結合腔，這為之後的研究提供了什麼啟發？

竺淑佳團隊：

在NMDA藥理學研究中，N端結構域，配體結合域以及門控通道的跨膜區都發現過不同小分子的結合位點。以往認為，這段LBD-TMD連線區域更多地起到將配體結合域構象變化傳遞給門控通道的作用。同時，這個鉸鏈區構象的動態性制約了我們對其更加深入的機制研究。

我們首次在這個區域發現了一個全新的小分子結合的調節位點，不僅豐富了NMDA受體功能藥理學研究，同時也給研究這個重要鉸鏈區結構域提供了新的結構資訊。為將來針對這個鉸鏈區結構域的功能學和結構學研究提供了新的思路和小分子工具。希望這項發現可以推動領域真正理解該結構域在整個NMDA受體門控機制中發揮的重要作用。當然，這個結合位點也為NMDA受體的新藥研發提供了新的啟示。

CellPress：

在GluN1-GluN2A和GluN1-GluN2B受體之間，競爭性拮抗劑和激動劑引起門控轉換的分子機制是否一致？研究如何證明了這一點？

竺淑佳團隊：

GluN1-GluN2A與GluN1-GluN2B之間的蛋白同源性較高，但是在已知得到的蛋白結構中仍然存在一些差異。之前有報道使用GluN1-GluN2B解釋了其競爭性拮抗劑和激動劑引起門控轉換的分子機制，我們進一步透過結構的比較，引入了三個比較引數來量化結構變化（亞基間角度，配體結構域D1-D2距離和D2-門控通道Pore的距離），發現在門控機制的轉換方面，GluN1-GluN2A與GluN1-GluN2B之間相對保守。

CellPress：

在解析GluN1-GluN2A NMDA受體與不同配體結合的冷凍電鏡（cryo-EM）結構時遇到了哪些困難？團隊是如何解決的？

竺淑佳團隊：

主要由於GluN1-GluN2A亞型NMDA受體本身通道處於高活性狀態，導致蛋白的穩定性不是很好。同時由於受體跨膜區構象異質性高，使得受體跨膜區的電鏡密度不是很好。實驗中我們匯入的一對半胱氨酸突變可以有效地提高蛋白的穩定性，在最佳化蛋白製備過程後可以得到較為穩定的四聚體蛋白。在冷凍電鏡資料處理過程中，我們透過最佳化電鏡資料處理步驟，透過多次最佳化後最終得到更高解析度的蛋白結構，為我們的研究提供了更有利的證據。

通訊作者簡介

竺淑佳

研究員

竺淑佳，研究員，博士生導師，中國科學院腦科學與智慧技術卓越創新中心（神經科學研究所）突觸蛋白的結構與功能研究組組長。2013年獲法國巴黎第六大學神經生物學博士學位，博士論文得到法國教育部最高論文等級評定。2013-2016年分別在法國巴黎高師和美國Vollum研究所從事博士後研究工作。2016年8月加入中科院神經科學研究所，併入選腦科學與智慧技術卓越創新中心年輕骨幹。入選國家級人才專案及上海市啟明星計劃。擔任中國神經科學學會離子通道與受體分會常委、上海市生物物理學會理事及Neurosci Bull青年編委。主持國家自然科學基金面上專案、國際合作與交流中法專案、中科院先導B專項及上海市市級科技重大專項等基金。以通訊或第一作者在Cell， Neuron， NSMB， PNAS， Cell Rep， Cell Res等期刊上發表多篇研究論文。

研究團隊

相關論文資訊

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▌論文標題：

Gating mechanism and a modulatory niche of human GluN1-GluN2A NMDA receptors

▌論文網址：

https：//www。cell。com/neuron/fulltext/S0896-6273（21）00410-4#%20

▌DOI：

https：//doi。org/10。1016/j。neuron。2021。05。031