基因編輯技術是指透過核酸酶對靶基因進行定點改造，實現特定

DNA的定點敲除、敲入以及突變等，最終下調或上調基因的表達，以使動植物、細胞等獲得新表型的一種新型技術。

目前基因編輯技術主要包括：（

1）鋅指核酸酶技術（ZFN）；（2）轉錄啟用子樣效應因子核酸酶技術（TALEN）；（3）規律性間隔的短迴文序列重複簇（CRISPR） 。目前，

CRISPR-Cas9

系統應用最為廣泛，可對基因組

DNA進行編輯，Cas9蛋白首先與crRNA及tracrRNA結合成複合物，透過PAM序列結合並侵入DNA，形成RNA-DNA複合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂，並啟動DNA損傷修復機制。CRISPR-Cas9技術在靶點驗證、藥物分子的高通量篩選、遺傳性疾病的治療等領域得到了廣泛的應用。

eSpCas9

上圖為

CRISPR基因編輯實驗中常用

的

載體。

eSpCas9

（

Enhanced specificity SpCas9

），

增強特異性

SpCas9（eSpCas9）也稱為SpCas9（K848A/K1003A/R1060A），提高了Cas9蛋白對靶點基因的特異性，由Broad研究所張峰實驗室構建（Slaymaker et al

。

2016）。eSpCas9能夠減少超過10倍的對目的基因的脫靶效應，同時保持對靶基因強大的編輯效率。它主要包括

以下

幾個部分

：

1。 ori

ori是origin的縮寫，它是DNA序列上固定的複製起始點。ori對於宿主擴增質粒的能力

至關重要。

2。 U6 promoter

U6啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列，一般位於轉錄起始位點上游。U6啟動子，屬於真核生物RNA聚合酶III，無物種特異性。

3

。 C

AG

enhancer

C

AG

增強子是

DNA上一段能與蛋白質結合的區域。與蛋白質結合後，基因的轉錄作用會增強。

4

。 FLAG

FLAG標籤，適用於基於抗體的親和純化。

5

。 Cas9

Cas9核酸內切酶，

該載體上的

Cas9蛋白是SpCas9即

Streptococcus pyogenes

）的

II型CRISPR/Cas系統，

同時

經過突變提高

了

靶向特異性。

另外一種廣泛使用的

Cas9蛋白是來自金黃色葡萄球菌

Staphylococcus aureus

）的

SaCas9。

6。

bGH poly（A）

terminator

bGH是真核生物mRNA3‘端的加尾訊號，用於轉錄終止，該訊號終止較弱。常用的轉錄終止子還包括SV40、hGH、rbGlob等，終止轉錄訊號較強。

7

。 f1 ori

f1噬菌體複製起始位點，其箭頭所指方向為鏈合成方向。

8

。 AmpR promoter

氨苄抗性基因的啟動子

9

。 AmpR

氨苄抗性基因

CRISPR-Cas9基因編輯載體構建

在植物中進行基因編輯通常需要同時構建

Cas

基因表達盒和

sgRNA表達盒。

Cas

基因的表達通常由

35S或Ubi等RNA聚合酶II啟動子驅動，以Nos終止子或其他終止子終止；sgRNA表達盒比較小，一般由長約300

bp的U3或U6等RNA聚合酶III啟動子驅動，以連續6個以上的T鹼基終止即可。目前常用的基因編輯載體骨架所有的元件都已構建好（包括

Cas

基因表達盒和

sgRNA scaffold），只需連入與靶位點配對的那一段sgRNA即可。設計合理有效的sgRNA是基因編輯的關鍵。

下面以人類

CD28基因為例手把手教大家如何設計sgRNA靶點。

1。 NCBI分析靶基因資訊

關注基因的轉錄本

ID、轉錄本數量、外顯子數量及長度、翻譯起始位點等資訊。

NCBI網址：

https：//www。ncbi。nlm。nih。gov/gene/

操作提示：第一步，開啟

NCBI，網址：

https：//www。ncbi。nlm。nih。gov/gene/

，選擇

Gene，輸入基因名稱物種：CD28 HUMAN，點選Search（見圖1）；第二步，點選第一個基因（見圖2）；第三步，下拉至轉錄本圖形區，瞭解常用Genbank資料命名形式： NM_標準的編碼轉錄本；XM_預測的編碼轉錄本；XR_預測的非編碼轉錄本；NR_標準的非編碼轉錄本；NC_、NG_、AC為基因組序列。方框表示外顯子，深綠表示編碼區，淺綠表示非編碼區。圖形區可知該基因有3個標準的編碼轉錄本，3個預測的編碼轉錄本（見圖3）。

圖1

圖2

圖3

2。 確定靶區域並獲取序列

挑選靶區域時應避免選擇與其他基因重疊的區域，不影響其他編碼基因表達；儘可能敲除所有轉錄本，敲除位點最好在編碼區的前

1/3，且避免敲除ATG所在的位置，確定待設計靶點的外顯子。

操作提示：第四步，針對轉錄本同源區以最短轉錄本

NM_001243078。2

為例開啟轉錄本序列，複製

NM_001243078。2

用

snapgene軟體開啟，點選Import，然後點選NCBI Sequence。輸入

NM_001243078。2

，點選

Import（見圖4）；第五步，點選Sequence，複製第一外顯子區域的序列

（見圖

5）

。

圖4

圖5

3。 設計sgRNA

以常用的張鋒實驗室

CRISPOR設計網站為例，點選“CRISPOR”， 填入待設計的外顯子序列、選擇對應的物種、Cas9型別，設計靶點。

（

其他設計工具，如

Benchling設計流程請點選檢視。

）

CRISPR/Cas9實驗實操專題一：sgRNA設計

網址

：

https：//zlab。bio/guide-design-resources

操作提示：第六步，開啟張鋒

CRISPOR設計網站，點選CRISPCR。貼上第一外顯子序列，選擇物種human和Cas9型別 ，以spcas9為20

bp+NGG（PAM）為例，點選SUBMIT（見圖6）。

圖6

4。 BLAST比對靶點特異性

挑選高評分靶點，進行

NCBI-blast，Blast結果分析，Max score完全匹配唯一， 在其他位置至少錯配3個鹼基，確保靶點在基因組特異性。

操作提示：第七步，選擇特異性評分在

70以上，預測有效性值越大越好，選擇排序前面的靶點（見圖7）；第八步，複製靶點序列，開啟NCBI Blast網站，和基因組資料庫比對靶點特異性，選擇物種human。輸入序列，點選Blast（見圖8）。結果顯示，第一個完全匹配20個鹼基，第二個匹配17個鹼基錯配3個，表示該靶點在基因組完全匹配一個，特異性良好。

圖7

圖8

在關鍵的的靶點篩選這步結束之後，接下來就要進行基因編輯載體構建。在構建載體前，應根據實驗目的選取合適的表達質粒。比如進行實驗考慮是否需要

reporter標籤，是否需要藥物篩選基因等。首先直接合成含有酶切位點、載體同源序列及20bp的sgRNA靶標序列和其反向互補序列；合成的sgRNA正反向鹼基（摩爾濃度為100 μM）進行退火，使之鹼基配對並形成雙鏈結構；選擇合適的酶切位點進行酶切質粒，並對酶切後的載體進行回收；將退火配對後的sgRNA鹼基與回收後的載體進行連線。連線產物進行轉化，氨苄抗性固體培養板進行塗板；挑取單克隆菌落，擴大培養後提取質粒，並使用通用引物對連線載體進行測序，檢測sgRNA鹼基片段是否正確插入載體質粒。

參考資料：

1。

Slaymaker IM， Gao L， Zetsche B， Scott DA， Yan WX， Zhang F （2016） Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity。 Science 351：84–88

2。

基因編輯的原理和載體結構

https：//zhuanlan。zhihu。com/p/580170374